Nature 612권, 162~169페이지(2022)이 기사 인용
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폴리-ADP-리보실트랜스퍼라제 탄키라제(TNKS, TNKS2)는 WNT-β-카테닌 신호 전달, 텔로미어 길이 유지, Hippo 신호 전달, DNA 손상 복구 및 포도당 항상성을 포함하여 광범위한 질병 관련 세포 과정을 제어합니다1,2. 이는 탄키라제 억제제의 개발을 촉진했습니다. 그럼에도 불구하고, 탱키라제 활성을 조절하는 메커니즘에 대한 우리의 지식은 여전히 제한적입니다. 탱키라제의 촉매 기능과 비촉매 기능은 모두 필라멘트 중합에 따라 달라집니다3,4,5. 여기에서 우리는 중합 멸균 알파 모티프(SAM) 도메인과 인접한 촉매 도메인으로 구성된 탱키라제의 최소 활성 단위에 의해 형성된 필라멘트의 저온 전자 현미경 재구성을 보고합니다. SAM 도메인은 새로운 역평행 이중 나선을 형성하여 반복되는 머리 대 머리 및 꼬리 대 꼬리 상호 작용을 위해 돌출된 촉매 도메인을 배치합니다. 머리 상호작용은 탱키라제 사이에서 고도로 보존되며 촉매 도메인 내의 활성 부위에서 알로스테릭 스위치를 유도하여 촉매 작용을 촉진합니다. 꼬리 상호작용은 촉매작용에 제한된 영향을 미치지만 WNT-β-카테닌 신호 전달에서 탱키라제 기능에 필수적입니다. 이 연구는 새로운 SAM 도메인 중합 모드를 밝히고, 초분자 조립이 촉매 및 비촉매 기능을 제어하는 방법을 설명하고, 비DNA 의존성 폴리-ADP-리보실트랜스퍼라제의 조절에 대한 중요한 구조적 통찰력을 제공하며, 탱키라제 및 비촉매 조절을 위한 향후 노력을 안내할 것입니다. 질병 메커니즘에 대한 기여를 해독합니다.
폴리(ADP-리보실)화(PARylation)는 광범위한 생물학적 활동과 관련된 번역 후 변형으로 널리 퍼져 있지만 잘 연구되지 않았습니다6. DNA 손상으로 유발된 폴리-ADP-리보실트랜스퍼라제 PARP1과 PARP2는 난소암, 유방암, 전립선암 및 췌장암의 치료 표적입니다7. 그들의 규정은 상당히 잘 이해되어 있지만 다른 두 PAR 생산 계열 구성원인 탄키라제 1과 탄키라제 2(각각 TNKS 및 TNKS2, 그림 1a)의 규정은 그렇지 않습니다8,9. Tankyrase가 조절하는 과정에는 WNT-β-catenin 신호 전달10, 텔로미어 길이 유지 및 응집력11, Hippo 신호 전달12, 포도당 대사13, 유사분열14 및 DNA 복구15가 포함됩니다. 이러한 기능은 암, 신경변성, 당뇨병 및 섬유증에 대한 잠재적인 치료적 유용성을 지닌 탄키라제 억제제의 개발을 장려했습니다. Tankyrases는 중합 SAM 도메인3,4,5,17을 통해 나선형 필라멘트로 조립됩니다. 탱키라제의 중합은 (1) 기질의 결합과 (2) PARP 촉매 활성화4,5,18를 촉진하며, 촉매 의존적 및 촉매 독립적(스캐폴딩) 메커니즘을 통해 WNT-β-카테닌 신호 전달에서 탱키라제 기능에 필수적입니다4, 5,18.
a, TNKS 및 TNKS2의 도메인 구성. b, TNKS2 SAM-PARP(왼쪽)와 PARP를 마스킹한 후(오른쪽)의 Cryo-EM 맵(모델 구축을 위해 Phenix에서 최종 선명화 전). 역평행 원형필라멘트는 D1 대칭으로 서로 관련되어 있습니다. A, 수용체 사이트; D, 기증자 사이트. 노란색 화살표는 프로토필라멘트 극성을 나타냅니다. c, 서로 다른 프로토머를 나타내는 문자를 사용한 4차 필라멘트 구조의 도식적 표현(확장 데이터 그림 3j 참조). d, 단일 TNKS2 SAM-PARP 프로토머의 추가로 날카로운 극저온 EM 맵 및 모델. PDB 5NWG33의 PARP 도메인은 수락자 사이트의 제대로 해결되지 않은 기능을 설명하기 위해 녹색으로 겹쳐져 있습니다. 데이터 처리 세부 사항은 확장 데이터 그림 2를 참조하고 G1032WTNKS2 돌연변이에 대한 지도 세부 정보 및 분석은 확장 데이터 그림 3을 참조하세요.
탄키라제 중합이 PARP 활성을 어떻게 유도하는지는 아직 알려지지 않았습니다. 여기서 우리는 탱키라제의 고분자 최소 활성 단위의 3Å 극저온 전자 현미경(cryo-EM) 구조를 설명하여 PARP 도메인 간의 상호 상호 작용을 통해 탱키라제를 알로스테릭하게 활성화할 수 있는 새로운 이중 나선 구조를 보여줍니다.
0.05). See Extended Data Fig. 9c,d for data from the +tankyrase inhibitor condition. g, Model for the activation of catalytic and non-catalytic tankyrase functions by polymerization. The dashed arrow indicates de-polymerization. Double-headed red arrows indicate interactions./p>monomeric); Fig. 5e and Extended Data Fig. 9a), in line with polymerization inhibition by auto-PARylation3. Additionally breaking SAM–SAM head-to-tail contacts (G1032WPARP Y920ASAM)4 resulted in nearly 100% monomers (Fig. 5e and Extended Data Fig. 9a). Although the PARP–PARP head combination mutant was just as catalytically impaired as G1032WPARP (see above), it appeared less polymeric (approximately 35% >monomeric), also than the wild-type protein, indicating that PARP–PARP head interactions contribute to polymerization. Note, however, that the studied species are probably dissociation products of larger polymers lost by dilution as PARP–PARP contacts are not expected to form in these very short filaments (see Discussion). The H1048AD-loop mutation conferred increased polymerization, comparable with G1032WPARP, suggesting that the associated reduction in catalytic activity is sufficient to favour polymerization (Fig. 5e and Extended Data Fig. 9a). Mutation of the interprotofilament contact (R896DSAM) and SAM/linker–PARP interface (on the SAM domain side) did not detectably reduce polymerization (Fig. 5e and Extended Data Fig. 9a). Variants containing combined PARP domain mutations in the PARP–PARP tail and SAM/linker–PARP interfaces appeared less monomeric, but presented with a higher tendency to stick to the glass surface, potentially due to aggregation, hindering reliable quantification (Extended Data Fig. 9a,b and Supplementary Video 1)./p>monomeric events, with s.e.m., using Microsoft Excel for Mac (v16.57) and GraphPad Prism (v9.3.1). Note that the quantifications in Fig. 5e and Extended Data Fig. 9b show the percentages of particles that are monomeric or multimeric; this is distinct from the percentages of protein molecules in different assembly states (monomeric or >monomeric). For example, a mass photometry peak corresponding to dimers and of equal height to the monomer peak contains twice as many proteins./p>monomeric species used for quantification. The three species marked with asterisks have poorer separation between peaks due to a higher tendency of molecules to repeatedly bind and unbind to and from the glass surface (see Methods for details). b, Analysis of mass photometry data for additional PARP domain mutant variants as in Fig. 5e (n = 5 independent experiments; individual data points and means; error bars, SEM). Data for controls (WT, G1032WPARP, G1032WPARP Y920ASAM) are identical to Fig. 5e and shown again for reference purposes. As for a, the three species marked with asterisks should be interpreted with caution. c, Fluorescence microscopy as in Fig. 5f, but after application of a tankyrase catalytic inhibitor. d, Quantification of c (n = 3 independent experiments; individual data points and means; error bars, SEM). e, Differential scanning fluorimetry of the indicated variants of His6-MBP-TNKS2 SAM-PARP. Data are means from three parallel technical replicates. f, g, Coomassie-stained SDS-PAGE gels of purified His6-MBP-TNKS2 SAM-PARP fusion proteins for quality control. Sufficiently high protein yield did not require repeated purifications for most of the variants (n = 1)./p>
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