세포외액 점도는 세포 이동 및 암 전파를 향상시킵니다.

Nature 611권, 365~373페이지(2022)이 기사 인용

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측정항목 세부정보

세포는 강성1, 유체 전단 응력2 및 수압3,4과 같은 물리적 자극에 반응합니다. 세포외액 점도는 암과 같은 생리학적, 병리학적 조건에 따라 달라지는 중요한 물리적 단서입니다5. 그러나 암 생물학에 미치는 영향과 세포가 점도 변화를 감지하고 반응하는 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. 여기에서 우리는 증가된 점도가 2차원 표면과 감금 상태에서 다양한 세포 유형의 운동성을 반직관적으로 증가시키고 3차원 종양 회전타원체로부터 세포 보급을 증가시킨다는 것을 입증합니다. 점도 상승으로 인한 기계적 부하 증가는 액틴 관련 단백질 2/3(ARP2/3) 복합체 의존적 조밀 액틴 네트워크를 유도하여 액틴 결합 파트너인 ezrin을 통해 Na+/H+ 교환기 1(NHE1) 분극을 향상시킵니다. NHE1은 세포 부종을 촉진하고 막 장력을 증가시켜 일시적 수용체 전위 양이온 바닐로이드 4(TRPV4)를 활성화하고 칼슘 유입을 중재하여 RHOA 의존성 세포 수축성을 증가시킵니다. 액틴 리모델링/동역학, NHE1 매개 팽창 및 RHOA 기반 수축성의 조화로운 작용은 점도가 높아질 때 운동성을 향상시킵니다. 증가된 점도에 미리 노출된 유방암 세포는 Hippo 경로의 전사 제어를 통해 TRPV4 의존적 기계적 기억을 획득하여 제브라피시에서의 이동 증가, 병아리 배아에서의 혈관 외 유출 및 생쥐의 폐 군집화로 이어집니다. 누적적으로, 세포외 점도는 암 생물학과 병리생리학적 관련성이 있는 단기 및 장기 세포 과정을 모두 조절하는 물리적 단서입니다.

세포 이동은 발달, 조직 항상성, 면역 감시 및 암 전이와 같은 다양한 병리생리학적 과정에 필수적입니다. 세포-기질 상호작용과 주변 유체로 인해 발생하는 기계적 힘이 세포 이동 거동을 조절하는 것으로 나타났지만6,7,8 생리학적으로 관련된 세포외 점도가 세포 기능에 미치는 영향은 불분명합니다. 현재까지 운동성을 포함한 대부분의 체외 세포 기능 분석은 물의 점도에 가까운 배지(37°C에서 0.7센티푸아즈(cP))에서 수행됩니다. 그러나 간질액의 점도는 최대 3.5cP까지 다양하며(참조 9) 다양한 조직의 상주 상피 세포뿐만 아니라 종양 세포에서도 분비되는 뮤신과 같은 거대분자에 의해 더욱 증가될 수 있습니다. 원발성 종양의 성장은 림프관을 압박하고 배수를 손상시켜 시간이 지남에 따라 거대분자가 축적될 수 있습니다. 종양 부위에서 세포외 기질의 분해가 증가하면 거대분자 밀집 현상이 악화되어 간질액의 점도가 더욱 높아질 수 있습니다. 특히, 전혈의 생리학적 점도는 4~6cP 사이로 다양하며, 병리학적 이상이 있는 경우 8cP를 초과할 수 있습니다14.

이전 연구에서는 초생리학적 점도(≥40 cP)가 2차원(2D) 표면에서 암종과 정상 세포의 운동성을 증가시키는 것으로 나타났습니다. 점도가 유체 내 입자의 움직임을 느리게 하기 때문에 이는 다소 반직관적입니다. 그럼에도 불구하고 세포가 생리학적으로 관련성이 높지만 세포외 점도의 물리적 신호를 어떻게 감지하는지를 포함하여 주요 기본 및 번역 질문에 대한 답이 남아 있습니다. 증가된 점도가 세포 표현형과 세포 이동의 기본 메커니즘을 변경하는지 여부; 높은 점도에서 효율적인 이동을 중재하기 위해 세포골격이 이온 채널 및 운반체와 어떻게 협력하는지; 시험관 내에서 관찰된 더 빠른 운동성이 생체 내 설정으로 해석되는지, 그렇다면 증가된 점도에 대한 세포 노출이 암 전이에 영향을 미치는지 여부.

시험관 내에서 증가된 세포외액 점도가 세포 기능에 미치는 영향을 조사하기 위해, 우리는 37세에 0.77cP(0%)에서 8cP(0.6%) 범위의 점도를 갖는 배지를 얻는 데 필요한 65kDa 메틸셀룰로오스의 양을 세포 배양 배지에 통합했습니다. °C에서는 배지의 삼투압을 크게 변경하지 않습니다(확장 데이터 그림 1a,b). MDA-MB-231 유방암 세포를 모델로 사용하여 PDMS(폴리디메틸실록산) 기반 제한(너비 × 높이 = 3.5 × 10μm2) 채널 내부의 이동 속도가 세포외 점도가 증가함에 따라 증가한다는 것을 발견했습니다(확장 데이터 그림 1c). , 5-8 cP에서 최고점에 도달했습니다 (그림 1a). 덱스트란(500kDa)2 및 폴리비닐피롤리돈 K-90과 같은 대체 생물학적 불활성 거대분자를 사용하여 점도가 높은(8cP) 매체도 더 빠른 운동성을 지원하는 반면(확장 데이터 그림 1d-f), 저분자량 덱스트란은 500kDa 덱스트란과 유사한 몰농도(~1.95μM)로 사용된 (6kDa)는 제한된 이동을 강화하지 않았습니다(확장 데이터 그림 1g). 이러한 데이터는 증가된 세포외액 점도가 거대분자의 특성과 관계없이 구속 상태에서 MDA-MB-231 세포 이동을 향상시킨다는 것을 보여줍니다. 증가된 점도에서 향상된 이동 속도는 또한 다양한 종양 세포(유방암(이하 BrM2)18, SUM159 유방암19 및 인간 골육종(HOS)에서 유래된 MDA-MB-231-BrM2 뇌 전이 세포)과 비암성 세포( 정상적인 인간 섬유아세포 및 인간 대동맥 평활근 세포(hAOSMC))(그림 1b).

0.96. The x axis is discontinued between 0.25 and 0.75 to highlight differences at the cell edges. n, Confined migration speeds of SC versus ARP3/ARPC4 double-knockdown cells (n = 90) from 3 experiments. For e, g, j and n, data are mean ± s.d. Unless otherwise indicated, statistical comparison was performed with respect to 0.77 cP. Statistical analysis was performed using Kruskal–Wallis tests followed by Dunn's test (a and n), Mann–Whitney U-tests (BrM2 only) or unpaired t-tests after log-transformation (other cells) (b), unpaired t-tests (e, g and j) and two-way analysis of variance (ANOVA) followed by Šidák's test (h and m). Scale bars, 250 μm (c), 50 μm (d), 25 µm (f, white), 3 µm (f, red), 10 µm (h), 2 µm (i), 20 µm (l). The cell model was MDA-MB-231 unless otherwise indicated. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001./p>

5 nuclei./p>8 data points, the D’Agostino–Pearson omnibus normality test was used to determine whether data were normally distributed. Datasets with Gaussian distributions were compared using two-tailed Student's t-tests and one-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test. For log normal distribution, statistical comparison was made after logarithmic transformation of the data followed by unpaired two-tailed Student's t-tests or one-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test. For non-Gaussian distributions, nonparametricMann–Whitney U-tests were used comparing two conditions, and comparisons for more than two groups were performed using Kruskal–Wallis tests followed by Dunn's multiple-comparison test. Select experiments were analysed using two-way ANOVA followed by Šidák's or Tukey's multiple-comparisons test. Analysis was performed using GraphPad Prism 7, 8 or 9 (GraphPad Software). P < 0.05 was considered to be statistically significant; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. The exact sample size, number of replicates, P values and statistical tests performed are provided in Supplementary Information 5–19./p>

200 cells per ROI imaged, for ≥6 ROIs from 2 experiments. l, Cell entry time in confining channels at the indicated viscosities. Data represent the mean ± s.d. for n = 52 cells from 3 experiments. Tests performed: Kruskal-Wallis followed by Dunn's multiple comparisons (e–g), unpaired t-test (i), and after log transformation of data (h,l), and two-way ANOVA followed by Šidák's multiple comparisons (j,k)./p>

450 events in 20 cells per condition imaged over 3 experiments. h, (Top) Snapshots of confocal micrographs of Lifeact-GFP-expressing MDA-MB-231 cells on 2D at 0.77 cP and 8 cP. The dashed yellow lines are used for kymographs at the bottom. At 0.77 cP, the leading edge extends and contracts rapidly as indicated by the "spikes" in the kymograph (red arrowheads). At 8 cP, the leading edge has slow yet persistent growth (yellow arrowhead) with occasional retraction events (red arrowhead). White bars: 10 µm; for kymographs, black horizontal bar: 5 µm and vertical bar: 30 s. i, Representative time-lapse confocal image sequence of PA-GFP fused actin dynamics after it is activated at the interior of cells on 2D. Red "X" symbols indicate points of UV excitation. Scale bar: 25 µm. j,k, Uninterrupted protrusion growth rate (j) and retrograde actin flow rate (k) in β-actin-mRFP-PAGFP-expressing MDA-MB-231 cells on 2D at 0.77 and 8 cP. Data are mean ± s.d. for n≥ 36 cells from 3 experiments. Tests performed: Two-way ANOVA followed by Šidák's multiple comparisons (b,c), Kruskal-Wallis followed by Dunn's multiple comparisons (d,e), Mann Whitney test (j), and unpaired t-test (k). Images are representative of 3 (a,h,i) experiments./p>

0.05 for all time points between 0.77 and 8 cP for SC versus dual shMIIA/MIIB (m) and vehicle versus Y27632 (n). o,p, (Left) Confocal images showing the spatial localization of MIIA-GFP in cells migrating on 2D at 0.77 and 8 cP (o) or 8 cP only in the presence of vehicle control or Y27632 (p). (Right) Intensity profile along dashed red line in corresponding images. Intensity was normalized to the highest intensity along the scan. Scale bars: 10 µm. q–t, Retrograde actin flow rate (q) and uninterrupted protrusion growth rate (s) in wild-type cells expressing β-actin-mRFP-PAGFP on 2D at 8 cP in the presence of vehicle control, Y27632, GSK 2193874 (GSK2) or CK666. Similar measurements were made for SC and shMIIA cells (r,t). Data are mean ± s.d. for n≥21 cells from ≥2 experiments. Tests performed: Mann Whitney test (a,b,r), unpaired t-test (c) and after log transformation (t), Kruskal-Wallis followed by Dunn's multiple comparisons (e,k,q,s), one-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparisons (f), one-way ANOVA followed by Tukey's between segments in each group (h), and two-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparisons (m,n). Images in i,o,p are representative of 2 and in g of 5 biological replicas. Cell model: MDA-MB-231./p>

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